Nieinwazyjna diagnoza odrzucenia nerkowego aloprzeszczepu przez pomiar RNA dla perforiny i Granzyme B w moczu cd

Ta grupa została sklasyfikowana jako opóźniona funkcja przeszczepu. Immunosupresja opierała się na schemacie opartym na cyklosporynie lub na tacrolimusie, z przeciwciałami antyfosfocytowymi (muromonab-CD3 [OKT3] lub globuliną antyitocytową) podawanymi w przypadku epizodów ostrego odrzucenia opornego na glikokortykoidy.25 Badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną w Weill. Kolegium Medyczne Uniwersytetu Cornell i każdy pacjent dał pisemną (lub doustną, jeśli tylko próbki moczu były zaangażowane) świadomą zgodę.
Izolacja RNA
Mocz odwirowano przy 10000 xg przez 30 minut w 4 ° C. RNA ekstrahowano z peletki za pomocą komercyjnego zestawu (RNeasy minikit, Qiagen, Chatsworth, CA). Ponad 95 procent próbek moczu dało RNA odpowiednie do PCR. Dla każdej próbki .g RNA poddano odwrotnej transkrypcji do komplementarnego DNA (cDNA) .26
Konstrukcja specyficznych dla genów konkurentów DNA i ilościowa reakcja PCR
Rysunek 1. Rysunek 1. Projektowanie i budowa konkurentów DNA. Konkurent DNA cDNA z granzymem B wytworzono przez trawienie naturalnie występującego produktu PCR o 180 parach zasad (numer dostępu w GenBank M28879) z MseI i ligację subfragmentów z insertem DNA o 44 bp z odpowiednimi kohezyjnymi końcami w miejscu 5 i 3 końce. Konkurent DNA cDNA dla perforyny wytworzono przez trawienie naturalnie występującego produktu PCR o długości 176 par zasad (numer dostępu GenBank M28393) za pomocą NlaIII i ligację subfragmentów z insertem DNA o wielkości 36 pz. Konkurenta cDNA o długości 274 pz cyklofiliny amplifikowano za pomocą zmodyfikowanego sensownego primera, który zawiera zewnętrzny primer sensowny na jego końcu 5 i wewnętrznym sensownym sensie 16-bp pod subfragment na jego końcu 3 odpowiadającym sekwencjom 302 do 317 w obrębie naturalnie występujący produkt PCR (numer dostępu GenBank M60857).
Projekt i konstrukcja konkurentów DNA swoistych dla genu pokazano na fig. 1. cDNA granzymu B, perforyny lub cyklofiliny B amplifikowano z różnymi stężeniami konkurentów DNA. Produkty PCR rozdzielono przez elektroforezę, wybarwiono bromkiem etydyny i skanowano metodą densytometrii laserowej. 26 Określono ilościowo stężenia naturalnie występujących transkryptów genów, mierząc stosunek pasma cDNA do pasma konkretnego konkurenta. Poziomy transkryptu wyrażono w femtogramach określonego mRNA na mikrogram całkowitego RNA.
Analiza statystyczna
Użyliśmy oprogramowania SAS (SAS, wersja 7.0, SAS Institute, Cary, NC) do analizy danych. Zanim porównaliśmy poziomy mRNA w stanie stacjonarnym w różnych grupach, zbadaliśmy normalność rozkładów poziomów transkryptów. Poziomy mRNA dla perforyny, mRNA granzymu B i mRNA cyklofiliny B znacznie się różniły od rozkładu normalnego (P <0,001), a zakres odchyleń znacznie się zmniejszył dzięki zastosowaniu transformacji logarytmicznej. Użyliśmy logarytmu naturalnego (ln) poziomów mRNA jako zmiennej zależnej w jednokierunkowej analizie wariancji 27 na mieszanym poziomie w celu zidentyfikowania różnic między czterema grupami. Następnie użyliśmy testu Dunnetta do wielokrotnych porównań, aby kontrolować ryzyko błędu typu I podczas porównywania poziomów mRNA w grupie ostrego odrzucenia z grupą w grupie z innymi ustaleniami, grupą z przewlekłą alloprzeszczepową nefropatią i grupą z stabilny kurs po transplantacji [hasła pokrewne: oczopląs pionowy, olx lwówek śląski, kortykotropina ] [podobne: tu olx lwówek śląski, olx lwówek śląski, wątroba muszkatołowa ]